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Etablierung einer automatisierten Plattform zur Transkriptom- und Epigenomanalyse einzelner Zellen

Bei vielen Erkrankungen spielen epigenetische Modifikationen durch Methylierung von Cytosinen eine wichtige Rolle. Da sich Veränderungen des Epigenoms einer Zelle auf die Expression von Genen, also auf das Transkriptom der Zelle, auswirken, wäre es wünschenswert, epigenetische Veränderungen direkt mit der Expression auf RNA-Ebene korrelieren zu können. Im vorliegenden Projektantrag soll daher eine Methode zur gleichzeitigen Hochdurchsatz-Multiparameteranalyse von Epigenom und Transkriptom einzelner Zellen entwickelt und validiert werden. Die Methode soll dazu eingesetzt werden, Neurone und Mikroglia in Mausmodellen für ausgewählte neurodegenerative Erkrankungen auf Einzelzellebene zu charakterisieren. Im nächsten Schritt soll überprüft werden, ob sich entsprechende Signaturen auch in Blutzellen von erkrankten Tieren erkennen lassen. Die Methode soll parallel auch zu Charakterisierung von minimal-invasiv gewonnenen zirkulierenden Tumorzellen von Patienten mit Prostata-Karzinom verwendet werden.

Abb TAB Webseite

A high-throughput method for parallel sequencing of tranriptome and epigenome of individual cells. A, Schematic representation of the principle of the drop-seq method (modified according to Macosko et al., 2015, Cell). The particles suspended in lysis reagent are located in the central channel, the cells are passed through the upper and lower channel and are enclosed with the particle in a droplet and lysed. B, heterogeneous tissue is dissociated into single cells and enclosed in the droplet together with a bead with individual primer sequence. The "barcode" is the same for all primers of a bead, but unique with respect to the other beads. After dissolution of the droplets, all indexed mRNA fragments can be amplified and sequenced. C, D, Structure of the mRNA primer (C) and DNA primer (D) consisting of a patient ID, the microparticle-specific barcode, the UMI (unique molecular identifier) and the mRNA adapter (poly-dT) or DNA adpater sequence, respectively. E, Schematic representation for the preparation of beads which have cleavable DNA primers and non-cleavable mRNA "primers" coupled. Both primer types have the same specific recognition sequence (see C and D). After binding of the primers to mRNA and DNA and the resulting indexing of the fragments, the mRNA on the microparticles can be magnetically separated from the DNA fragments and both can be sequenced independently. F, Schematic representation  of a dual primer synthesis, which is achieved by an independently controlled deblocking and coupling of bases to the mRNA or DNA primer, whereby same sequences (patient ID and microparticle-specific barcode) but also different sequences (mRNA adapters or DNA adapter) can be synthesized. G, Schematic representation of a "split and pool" method for generating specific recognition sequences that are coupled to the beads as described by Macosko et al. (2015). The assignment of the different mRNA species to a cell takes place after sequencing by reading out the randomly generated detection sequence.